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技术文章 > 支原体培养的技巧

支原体(霉形体)的培养技巧支原体是介于病毒与细菌之间的一类微生物,在自然界广泛存在,使人和多种动物、植物害病。

它缺乏细胞壁而不同于细菌,能在无细胞培养基生长繁殖,并含有RNA和DNA而有别于病毒。支原体以二分裂方式繁殖,基本形态为圆形、丝状形,后者易形成分枝状菌丝,因而得名支原体。其大小介于病毒和细菌之间,最小直径125-250nm,可通过滤器。基因组小只5×108道尔顿,是已知能自行复制繁殖的原核生物中最小的,因而生物合成能力低,体外培养时需要富含营养,如血清、酵母浸液、核酸等复杂成分的培养基才能生长。它生长缓慢,倍增时间1-6小时,最长需三周才形成菌落。菌落中心长入琼脂内部形成中央较密的核,从上方观察可见“煎蛋样”的特殊菌落,因为菌落很小需在低倍镜下才能看见。Mp从发酵葡萄糖取得生长所需能量。Uu则是通过水解尿素获得能量。支原体对抑制细胞壁合成的青霉类抗生素不敏感,对抑制蛋白质合成的抗生素如四环素和大环内酯类抗生素的红霉素等敏感。

一般培养比较多的是肺炎支原体(MP),解脲脲原体(UU)是耐酸不耐碱的,UU培养的原理是在于其菌体中含有脲酶,而UU培养基中含有尿素,UU的生长需要其本身的脲酶分解尿素益提供其自身生长所需要的营养物质,UU培养基中含有指示剂酚红,由于尿素被分说明放出氨从而使培养基变碱而使培养基由黄变红,但是这种红是一种清亮的红色,透明澄清无浑浊,UU其适宜的PH值为6.2-6.5,由于尿素分解产氨是PH上升,UU在PH值大于7的条件下会迅速死亡,因此,在培养时要随时观察其液体培养基的PH值,一旦看到培养基变红,要马上取出,以防培养基PH上升导致UU死亡,一般UU需要在培养至对数生长期时是活力最强的时候(培养基呈橙红色变化)。一般UU生长需要24小时。

UU的计数也和普通细菌不同,采用颜色单位改变法(CCU法),因为UU的生长是澄清清亮透明的,因此无法用一般的比浊法来计数!

UU的保存:在UU生长到对数生长期时,采用甘油保存法,甘油和菌液的比例为3:7,(甘油高压灭菌),采用程序降温法,献4度1小时,在-20度2小时,最后放到-80度,但是在-80度最长不要超过半年,因此需要每隔2-3个月将菌株复苏一次到对数生长期后再保存!

另外,UU生长所需要的培养基的成分一般每隔单位有所不同,但是有一点肯定,就是需要小牛血清。

器具泡酸的目的是为了去除杂质,一般在做细胞培养是需要泡酸,做细菌方面的工作要求不需要如此严格的,只需要洗干净,高压消毒就可以了,在配培养基时用的是三蒸水,把培养基配好后,最后再加入血清,然后调到所需的PH值,不可以高压,只能用0.22um的滤膜过滤除菌!培养基配好后,4度放半年没问题!

没有从动物身上分离UU,但是刚一开始做时,是从病人的临床分泌物中分离,临床分离株需要纯化,因为临床株常常含有很多杂质,这些杂质会影响UU的生长,导致UU的CCU常常达不到10的3次方,因此对临床株需要纯化,可以在固体平板上见到油煎蛋样菌落,用灭菌小刀切取菌落琼脂块,移入液体培养基中压碎进行培养,等到培养基变黄后,用液体培养基稀释培养物到10的-4或-5次方,再取0.2-0.4ml于固体平板上,这样反复2-3次,就可以得到支原体的纯种。

CCU一方面和细菌本身浓度有关,另一方面,确实与培养基成分有很大关系,如果培养基营养成分差,很难作出来,如果培养基中只含有盐成分的话,高压是没问题的,如LB培养基,但是如果里面含有小牛血清或糖类等物质的话,绝对不可以高压,因为这样会破坏营养成分,只可以过滤除菌!
解脲脲原体培养基配制:(在自制培养基基础上加:)PH:6。13
  小牛血清:30ml/250ml
  10%尿素:12 ml/250ml
  0.2%酚红:4。5 ml/250ml
  青霉素G:50万U/250ml
  酵母:6。25 g/250ml
  磷酸二氢钾:0。375 g/250ml
  天门冬素:0。025 g/250ml
自制培养基包括:新鲜牛肉浸液:90毫升
  蛋白胨:1克
  氯化钠:0。5克
  磷酸二氢钾:0。15克
  (此自制培养基可以高压灭菌)。
加琼脂配成固体,一般1%即可!



支原体是能够在无生命培养基上生长的最小微生物,其生长特点是在液基中是清亮的,因此他的计数无法通过比浊法,其对数生长期在液体中的表现是表现为橙红色,这是支原体的代谢活力旺盛,如果颜色呈现桃红色或深红色,这时UU的活力就会下降,因为UU的最合适PH为6.0-6.5,这时培养基的PH偏碱,UU可能已死亡。为了区分颜色,可以用一管液体培养基作为颜色改变对照,黄色和橙红色还是比较好区分的!

Uu的最适生长PH在6.0-6.1之间,这可能与培养基的配制有关。关于Uu的计数,CCu是最好的方法:200ul菌液加入第一瓶1.8ml液态培养基中混匀,然后从中取出200ul加入第二瓶1.8ml液体培养基中,混匀,以此类推,10倍稀释11瓶,做3组平行试验,求平均值即可。注意,每步操作都要换枪头。

对于Uu的保存,其实方法也很简单:
  1、用液体培养基培养15-17h(溶液有桔黄色变为橙红色,而且基本在对数生长期左右),直接放入0度或-20度,2个月是没问题的,如果不放心的话,可隔一个月检查一下活性。
  2、如果条件允许的话,可将培养至对数生长期的阳性液先预冻,然后抽真空即可。保存几年是没问题的。复苏的时候,直接向其中加入Uu培养基培养即可。
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