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技术文章 > DNA萤光染色法检测支原体

原理
利用萤光染剂(bisbenzimide, Hoechst 33258)侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域,因为支原体之DNA中A-T含量占多数(55~80%),所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后,在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点,即为支原体之DNA,证明有支原体之污染。

测试步骤用间接步骤,将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中(indicator cell,例如Vero cell or 3T6 cell),然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。

待测细胞亦可作直接测试,但需为吸附型细胞,培养后直接作萤光染色。有些细胞易有萤光背景,而干扰结果判读,则建议使用接种于指示细胞之步骤。
特点
简单、经济与灵敏,广泛使用,可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体,例如M. hyorhinis,较直接培养法快,约一星期即可知道结果。

缺点:有时仍会有萤光背景,影响判读。

材料
Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物:35 or 60mm sterile plate内放置无菌22x22mm盖玻片﹙浸于酒精内,使用前过火灭菌﹚,一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片,细胞面朝下放在玻片上观察。

Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070),细胞须先测试无污染。αMEM with 10%FBS ( medium for Vero cell)
配制试剂:

无菌HBSS:配制Hanks’ balanced salt solution,以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。勿用高压蒸汽灭菌。

Hoechst 33258 stock solution(100X)︰称取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml无菌HBSS,置于棕色瓶中,室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后,以1ml分装至1.5ml小离心管中,贮存于-20℃。

Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution,加入sterile 100 ml HBSS中,室温下搅拌45分钟,置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆,避免光照,贮存于4℃。

mounting solution:22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合,以1 N NaOH调整pH至5.5(pH很重要),贮存于4℃。
固定溶液(fixative):冰醋酸与甲醇以1︰3之体积比例混合,使用前才配制。
步骤:
培养Vero细胞: Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管,测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。
在接种测试样品前一日,以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞,制成细胞悬浮液,以1~2x10^4 cells/ml培养于chamber slide中,每个well加入1ml细胞悬浮液,于37℃, 5%CO2培养。隔日确定生长良好后,即可接种测试样品。
接种测试样品:样品种类:1ml待测之培养基,1ml待测细胞培养液(可将细胞稍微刮下﹚,0.05~0.1ml冷冻管之细胞悬浮液。
将测试样品加入chamber slide内,培养5天后,进行Hoechst 33258的萤光染色观察。
以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero细胞作为正反应对照组﹙或是已感染支原体之细胞培养液或冷冻细胞液﹚,负反应对照组为Vero cell之新鲜培养基( αMEM +10%FBS)。
DNA萤光染色检测:

取出培养5日之Vero细胞,吸除培养液。于每个well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液,静置10 min后,吸除固定液。重复上述之步骤,风干10分钟。

于每个well中,加入1 ml Hoechst 33258 working solution,室温下静置30 min。

吸掉Hoechst 33258染液后,以无菌水洗涤3次,风干后加入1滴的mounting solution,并以盖玻片覆盖之。

以100x-400x萤光显微镜观察。打开水银光源10 min后,以UV激发光束(330~380 nm)之滤光镜,观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物产生。
结果判读
若有支原体污染,在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。其形状一致,与细胞残片染成之不规则点状物不同。其萤光可维持数星期。
图例 (A)为negative result : 萤光显微镜下,只观察到Vero细胞的细胞核,测试样品没有支原体的污染。(为positive result : 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点,表示测试样品有支原体的污染。
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