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抗凝全血基因组DNA提取试剂盒(0.1-20ml血液)图片
产品货号:
WH0013
中文名称:
抗凝全血基因组DNA提取试剂盒(0.1-20ml血液)
英文名称:
Extraction kit for genomic DNA from Blood anticoagulated
产品规格:
50mL血|200mL血
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒采用独特的缓冲液系统,提取0.1-20ml加入各种抗凝剂的新鲜血液和冻存血液样品基因组DNA。本缓冲液系统可最大限度去除蛋白、色素、脂类及其他抑制性杂质污染。提取的基因组DNA片段大,产量高,纯度好,稳定可靠。本试剂盒避免使用苯酚、氯仿等有机溶剂,回收的DNA可适用于各种常规操作,如酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

提取得率:(根据血液样品中白细胞数量的不同,DNA产量有所差异)
材料保存时间提取量DNA产量OD260/OD280
人类全血4℃一周300μl3-10μg1.7-1.9
人类全血4℃一周1 ml4-30 μg1.7-1.9
人类全血4℃一周5 ml100-200 μg1.7-1.9
人类全血4℃一周10 ml200-400 μg1.7-1.9


试剂盒组成:
组分5ml血量200ml血量
细胞裂解液CL125 ml2×250 ml
缓冲液FG30 ml120ml
洗脱缓冲液TB30 ml60 ml
Proteinase K250 μl1 ml

保存条件:室温(15-25℃)干燥条件下,可保存12个月,更长时间的保存可置于2-8℃。2-8℃保存条件下,若溶液产生沉淀,使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间,必要时可在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀。

注意事项:(请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项)
1.血液样品反复冻融,会导致提取的DNA片段较小、且提取量下降。所得基因组DNA也应尽可能避免反复冻融,以免断裂。
2.血液样品的储存:
??a)短期保存:已加入抗凝剂的血液样品可在2-8℃储存最多10天,对于某些实验例如Southern杂交等,需要得到完整全长的基因组DNA,请将血液样品在2-8℃储存不超过3天,此时基因组DNA的降解程度较轻。
??b)长期保存:已加入抗凝剂的血液请置于-70℃保存(如果提取的是高分子量的DNA,推荐使用EDTA作为抗凝剂)
3.所有离心操作均可在室温下完成。

使用方法:

一、小体积全血操作流程(<600 μl血样;以300μl血液处理量为例)
1.向300μl抗凝剂的血液中加入750 μl细胞裂解液CL,颠倒混匀5次。
??注意:为方便与离心机配套使用,可加入与血液等体积的细胞裂解液CL,重复裂解两次。
2.12000rpm(~13400×g)离心1 min。倒弃上清,将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2 min,确保沉淀在管中(此步骤应小心操作,为避免沉淀被倒出,推荐使用尖底离心管)。
??注意:在极少的情况下沉淀可能会很松弛,所以要缓慢倒上清,将离心管倒置在吸水纸上是为了减少管壁上清的回流。
3.按照表1配制缓冲液FG与Proteinase K的混合液。
??注意:此混合液最好现用现配,并在配好后1h之内用完。
4.加入150 μl缓冲液FG与Proteinase K的混合液,马上涡旋混匀至溶液无团块。
??注意:当处理多个样品时,加入缓冲液FG和Proteinase K的混合液后要立即涡旋混匀,不要等所有的样品加完后再涡旋振荡。通常涡旋混匀5sec就足以混匀沉淀,但是有可能痕量的胶状沉淀难以混匀,此时可再次补加缓冲液FG和Proteinase K的混合液(具体补加量见表1),再次涡旋混匀。
5.65℃水浴10min,其间颠倒混匀数次。
??注意:随着蛋白的消解,溶液的颜色从红色变为黄绿色。
6.加入150 μl异丙醇,颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA。
??注意:与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要,应该仔细观察。对于白细胞数目很少的样品,DNA沉淀可能看不到,此时应该至少颠倒离心管20次确保沉淀完全。
7.12000rpm(~13400×g)离心5 min,倒弃上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上,确保沉淀在管中。
??注意:在极少的情况下沉淀可能会很松弛,所以要缓慢倒上清。如果样品的白细胞数量足够多,可以看到白色的DNA沉淀。
8.加入150 μl 70%乙醇,涡旋振荡5 sec,12000rpm(~13400×g)离心2 min,倒弃上清。
9.重复操作步骤8。
10.将离心管倒置在干净的吸水纸上停留至少5 min,确保沉淀在管中。
??注意:在极少的情况下沉淀可能会很松弛,所以要缓慢倒上清,将离心管倒置在吸水纸上是为了减少管壁中上清的回流。
11.空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净(至少5 min)。
??注意:乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。但是要避免过分干燥DNA沉淀,因为过于干燥的DNA很难溶解。
12.加入200 μl缓冲液TB,低速涡旋5 sec,65℃加热10min-1h溶解DNA,其间轻弹数次助溶。
??注意:如果DNA没有完全溶解,可室温过夜。如果使用少量的缓冲液TB溶解DNA,孵育时间可能需要延长。

二、中量全血操作流程(1-10 ml血样;以5 ml血液处理量为例)
1.向5 ml含抗凝剂的血液中加入5 ml细胞裂解液CL,颠倒混匀5次,3,600rpm(~2,000×g )离心2 min,倒弃上清;
2.再向其中加入7.5 ml细胞裂解液CL,颠倒混匀5次,3,600rpm(~2,000×g )离心2 min,倒弃上清,将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2 min,确保沉淀在管中(此步骤应小心操作,为避免沉淀被倒出,推荐使用尖底离心管)。
??注意:在极少的情况下沉淀可能会很松弛,所以要缓慢倒上清,将离心管倒置在吸水纸上是为了减少管壁上清的回流。
3.按照表1配制缓冲液FG与Proteinase K的混合液。
??注意:此混合液最好现用现配,并在配好后1h之内用完。
4.加入2.5 ml缓冲液FG与Proteinase K的混合液,马上涡旋混匀至溶液无团块。
??注意:当处理多个样品时,加入缓冲液FG和Proteinase K的混合液后要立即涡旋混匀,不要等所有的样品加完后再涡旋振荡。通常涡旋混匀5 sec就足以混匀沉淀,但是有可能痕量的胶状沉淀难以混匀,此时可再次补加缓冲液FG和Proteinase K的混合液(具体补加量见表1),再次涡旋混匀。
5.65℃水浴10-30 min,其间颠倒混匀数次。
??注意:随着蛋白的消解,溶液的颜色从红色变为黄绿色。
6.加入2.5 ml异丙醇,颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA。
??注意:与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要,应该仔细观察。对于白细胞数目很少的样品,DNA沉淀可能看不到,此时应该至少颠倒离心管20次确保沉淀完全。
7.3,600rpm(~2,000×g )离心8 min,倒弃上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上,确保沉淀在管中。
??注意:在极少的情况下沉淀可能会很松弛,所以要缓慢倒上清。如果样品的白细胞数量足够多,可以看到白色的DNA沉淀。
8.加入2.5 ml 70%乙醇,涡旋振荡5 sec,3,600rpm(~2,000×g )离心3 min,倒弃上清。
9.重复操作步骤8。
10.将离心管倒置在干净的吸水纸上停留至少5 min,确保沉淀在管中。
??注意:在极少的情况下沉淀可能会很松弛,所以要缓慢倒上清,将离心管倒置在吸水纸上是为了减少管壁中上清的回流。
11.空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净(至少5 min)。
??注意:乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。但是要避免过分干燥DNA沉淀,因为过于干燥的DNA很难溶解。
12.加入500 μl缓冲液TB,低速涡旋5 sec,65℃加热1h溶解DNA,其间轻弹数次助溶。
??注意:如果DNA没有完全溶解,可室温振荡过夜。如果使用少量的缓冲液TB溶解DNA,孵育时间可能需要延长。

三、大量全血操作流程(10-20ml血样;以10 ml血液处理量为例)
1.处理样品:
a.离心富集有核细胞进行核酸提取:将血样3,600rpm(~2,000×g )离心15-20 min,抽弃血浆,取中间白膜层细胞加入到15 ml离心管中,加入10 ml细胞裂解液CL,涡旋混匀10 sec,3,600rpm(~2,000×g )离心2 min,倒弃上清。再加入15 ml细胞裂解液CL,涡旋混匀10 sec,3,600rpm(~2,000×g )离心2 min,倒弃上清。
b.细胞裂解液CL处理血液标本分次富集有核细胞进行核酸提取:在15 ml离心管中添加细胞裂解液CL和血液样本(比例2.5:1),多次富集进行下游实验。
(例10 ml全血处理方式:在两个15 ml离心管中分别加入5 ml的全血和10 ml细胞裂解液CL,颠倒混匀5次,3,600rpm(~2,000×g )离心3 min,倒弃上清;再向其中加入2.5ml细胞裂解液CL,涡旋混匀10 sec,混合到一支离心管里,3,600rpm(~2,000×g )离心3 min,倒弃上清;进行下游操作。)
??注意:细胞裂解液CL处理步骤应小心操作,为避免沉淀被倒出,推荐使用尖底离心管。在极少的情况下细胞裂解液CL处理得到的沉淀可能会很松弛,所以要缓慢倒上清。
2.按照表1配置缓冲液FG与Proteinase K的混合液(比例100:1),对于10-20ml的全血标本,每个样品需要5 ml缓冲液FG与Proteinase K工作液。
??注意:此混合液最好现用现配,并在配好后1h之内用完。
3.加入5 ml缓冲液FG与Proteinase K的混合液,马上涡旋混匀至溶液无团块。
??注意:当处理多个样品时,加入缓冲液FG和Proteinase K的混合液后要立即涡旋混匀,不要等所有的样品加完后再涡旋振荡。通常涡旋混匀30 sec就足以混匀沉淀,但是有可能痕量的胶状沉淀难以混匀,此时可再次补加1 ml缓冲液FG和Proteinase K的混合液,再次涡旋混匀。
4.65℃水浴30 min,其间颠倒混匀数次。
??注意:随着蛋白的消解,溶液的颜色从红色变为黄绿色。
5.加入5 ml异丙醇,颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA。
??注意:与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要,应该仔细观察。应该至少颠倒离心管20次确保沉淀完全。
6.离心3,600rpm(~2,000×g )离心10min,倒弃上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上,确保沉淀在管中。
??注意:如果得到的团块过于松弛,可以延长离心时间或者增大离心力。
7.加入5 ml 70%乙醇,涡旋振荡5 sec,离心3,600rpm(~2,000×g )离心3 min,倒弃上清。
8.重复操作步骤7。
??注意:如果得到的团块过于松弛,可以延长离心时间或者增大离心力。
9.将离心管倒置在干净的吸水纸上停留至少5 min,确保沉淀在管中。
??注意:在极少的情况下沉淀可能会很松弛,所以要缓慢倒上清,将离心管倒置在吸水纸上是为了减少管壁中上清的回流。
10.空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净(至少5 min)。
??注意:乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。但是要避免过分干燥DNA沉淀,因为过于干燥的DNA很难溶解。
11.加入1 ml缓冲液TB,低速涡旋5 sec,65℃加热1h溶解DNA,其间轻弹数次助溶。
??注意:如果DNA没有完全溶解,可室温振荡过夜。如果使用少量的缓冲液TB溶解DNA,孵育时间需要延长。

附表1:不同体积血液所需各种缓冲液用量(μl)
血液体积(μl)1003001000300050001000020000
细胞裂解液CL(μl)25075025007500125002500050000
缓冲液FG(μl)5015050015002500500010000
Proteinase K(μl)0.51.55152550100
100%异丙醇(μl)5015050015002500500010000
70%乙醇(μl)5015050015002500500010000
缓冲液TB(μl)10020020030050010001000
补加缓冲液FG和
Proteinase K(μl)
103010030050010001000
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