网站旧版  |  加入收藏
金沙贵宾会官方0029客服电话金沙贵宾会2999comQQ金沙贵宾会2999comQQ金沙贵宾会2999comQQ
金沙贵宾会官方0029微信服务号

产品目录

植物线粒体DNA提取试剂盒图片
产品货号:
XH002
中文名称:
植物线粒体DNA提取试剂盒
英文名称:
Plant mitochondrial DNA Extraction Kit
产品规格:
50T|100T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒用于从植物叶片中分离出完整而纯化的线粒体。适合于田间采摘或者实验室培养的植物叶片中线粒体DNA的提取制备。线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心得到比较纯净的线粒体,再利用DNA酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA,最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。

试剂盒组成
组份50T100T保存温度
DNase I12mg22mg-20℃,溶解后分装
RNase A0.5ml1ml-20℃保存,经常使用可2-8℃放置
β-巯基乙醇1.0ml1.0ml*2常温,通风处保存
植物细胞裂解液100 mL200 mL2-8℃
线粒体清洗液25 mL50 mL2-8℃
DNA酶反应液6ml12ml2-8℃
线粒体裂解液10ml20ml常温放置,如有沉淀可37℃水浴
蛋白沉淀液7.5ml15ml2-8℃
核酸助沉剂0.5ml1ml2-8℃
TE缓冲液25ml50ml2-8℃

保存条件:2~8℃一年,RNase A及DNase I -20℃保存。使用前,在DNase I中加入600μL(50T)或者1100μL(100T)的DNA酶反应液,分装后-20℃保存三个月,如果超过三个月,活性可能会降低,请自行订购DNase I。线粒体裂解液使用前常温保存,如有沉淀可37℃水浴溶解,不影响使用。


操作步骤
准备工作:在DNASE I中加入600μL(50T)或者1.1mL(100T)的DNA酶反应液,适当分装后-20℃保存。线粒体裂解液保存于常温,如有沉淀37℃水浴溶解,离心机温度下降到4℃(2~8℃),如无低温离心机,也可以常温离心,并将离心时间为10min的改为5min,但最后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。

1.样本采集前处理:无论田间自然生长还是实验室组织培养,采摘前需避光生长24~48小时,以减少叶片组织中糖类及叶绿体含量。取适量植物细胞裂解液,加入0.5% β-巯基乙醇,10ml植物细胞裂解液加入50μLβ-巯基乙醇,混匀,形成植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,此溶液可2~8℃保存一个月。
2.叶片用蒸馏水清洗2-3次,滤纸吸干,有条件请用液氮研磨叶片1-2克,研磨完后,取800mg左右研磨的叶片粉,加入1.5ml预冷的植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,混匀。如果无条件(无液氮),请预冷研钵,取洗过的叶片1000mg,用剪刀剪为碎块放入玻璃匀浆器或者研钵中。加入1.5ml预冷的植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,冰上研磨至看不见明显组织块;
3.将研磨物放置合适的离心管,4℃,1000×g 离心5min;
4.将上清转移到一新的离心管中,在沉淀中加入0.5ml植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,混匀,再次4℃,1000×g离心5min,取上清;合并两次上清,将上清4℃ 1000×g再次离心5min。
5.取上清,加入一新的离心管中,4℃,16,000×g离心10min。离心后的上清含胞浆成分,可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管,线粒体沉淀在管底。
6.在线粒体沉淀中加入0.5 mL线粒体清洗液重悬线粒体沉淀,4℃,1000×g离心5min;
7.取上清,加入一新的离心管中,4℃,16,000×g离心10min。弃上清,高纯度的线粒体沉淀在管底;
8.加入100μL DNA酶反应液重悬线粒体,吹打均匀后,再加入10μL DNASE I溶液(见准备工作),混匀,37℃水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃,12,000×g离心5min。尽可能的弃上清,再加入200μL TE重悬线粒体沉淀,4℃,12,000×g离心5min,洗去残留的DNA酶。
9.得到的沉淀,用200μL TE缓冲液重悬线粒体沉淀,加入10μL RNase A。加入200μL线粒体裂解液,轻轻混匀(不可吹打),放置1~2min,再加入150μL蛋白沉淀液,迅速混匀。4℃,12,000×g离心5min。此步骤可进一步去除核DNA。
10.取上清,加入一新的离心管中(如用于酶切分析,可加入此步:选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1抽提一次,再用氯仿抽提一次,或者直接用氯仿抽提两次,一般来说,此步可去掉一些微量蛋白及糖类,但会造成线粒体DNA的损失,因而用于PCR时可省,并不影响后续实验),加入0.6倍体积的异丙醇(如无异丙醇,可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA,如离心管太满可分两管)及5~10μL 核酸核酸助沉剂,混匀,-20℃沉淀半小时左右(此步可省),4℃,12,000×g离心10min。
11.弃上清,再加入1ml 70%乙醇清洗,4℃,12,000×g离心5min。重复用70%乙醇洗一次。
12.弃上清,再次离心1min吸弃上清,不要碰到管底,开盖凉干约5~15min。
13.加入20-30μL TE缓冲液,轻弹管底,37℃水浴5分钟,线粒体DNA溶解。
14.进行DNA电泳检测及-20℃保存,进行下步的实验。

注意事项
1.以离心力g计算正确的离心速度,不同的离心机可据此精确计算离心速度。
2.进行Western Blot和2D-胶电泳,可直接在第7步的沉淀中加入上样缓冲液裂解线粒体。
3.β-巯基乙醇有毒,请注意通风及防护。
金沙贵宾会官方0029 |  关于咱们 |  联系咱们 |  在线咨询 |  网站地图
2013-2018 金沙贵宾会002999 京ICP备14007103号
XML 地图 | Sitemap 地图
Baidu
sogou