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产品目录

DNA片段化/末端修复/加dA尾试剂(Illumina)图片
产品货号:
WH0208
中文名称:
DNA片段化/末端修复/加dA尾试剂(Illumina)
英文名称:
Fragmentation/End repair/dA-tailing Reagent(Illumina)
产品规格:
24次|96次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本制品是专门针对于illumina高通量测序平台所优化的预混酶模块,包含了DNA片段化、末端修复以及3'端dA尾添加所需的所有酶类,可将双链DNA片段化为小片段,并分别在片段化DNA两端添加5'-P和3'端dA,所得产物无需纯化,可直接通过Fast Ligation Reagent(WH0201-01/02)用于adapter的连接。该模块采用一步法的反应流程,省去了多步纯化步骤,可对微量DNA样本进行高效、快速的片段化、末端修复及dA尾添加,操作更加简便,文库转化效率更高。

适用范围:用于双链DNA的片段化、末端修复及3'端添加dA,适用于illumina高通量测序平台DNA文库构建。
适用样本量:1ng~1μg DNA。

产品特点:
·单管酶促反应,一步完成双链DNA的片段化、末端修复、dA添加反应。
·高文库转化效率,DNA样本起始量可低至1ng。

产品组成:
组分24次96次
5×FEA Enzyme Mix240μl960 μl
10×FEA Reaction Buffer120 μl480 μl
FEA Enhance120 μl480 μl
Nuclease-Free ddH2O1ml4×1ml

保存条件:-25~-15℃保存,避免反复冻融,保质期为一年。

注意事项:(请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项)
1.操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染。
2.请使用不含RNA酶或DNA酶的枪头、EP管进行试验。
3.试验开始前,请清洁操作台,并使用RNA酶及DNA酶清除试剂,如RNase Away处理台面。确保没有RNA酶和DNA的污染。
4.进行文库扩增前,请确保PCR仪已经调试好并处于稳定的状态。
5.试验前请仔细阅读说明书,如果需要暂停试验,或者无需马上进行下游试验。可根据说明书推荐将试验产物保存于-20℃并安排后续试验。
6.由于使用本品所进行的片段化过程为酶促反应,故片段化过程对反应温度、反应时间、体系配制以及DNA上样量等因素较为敏感。强烈推荐用户按照本说明书所述步骤及优化的反应参数(如反应时间等)进行试验。

推荐使用的其他试剂:
1.Fast Ligation Reagent(WH0201-01/02)
2.NGS Library Amplification Reagent(WH0210-01/02)
3.Single-Index Adapter(Illumina)(WH0206-01/02/03)
4.BECKMAN Agencourt AMPure XP磁珠

操作步骤:

一、试验准备
1.在开始实验前,明确核酸的浓度及纯度至关重要,推荐上样量1ng~1μg DNA。DNA需溶解于以下溶液中:去离子水、10mM Tris、Buffer EB或LoTE(0.1×TE)等。
注意:
?确定上样DNA浓度至关重要,尤其在上样量低于100 ng时。推荐使用Qubit、Picogreen或者其他染料法对DNA浓度进行准确定量。
?请确认DNA溶液中不含阳离子及螯合剂。如果DNA溶解于1×TE或不确定DNA溶液中的EDTA浓度,请参照附录Ⅰ所述步骤,使用BECKMAN企业的Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化或参照附录Ⅲ进行片段化处理。
2.将各试剂置于冰上,5×FEA Enzyme Mix融化后用手指后轻弹混匀,不要涡旋。其余试剂可短暂涡旋混匀。

二、试验步骤
1.照下表设置PCR仪反应程序。开启热盖,热盖温度设置为70℃。
操作步骤温度时间
14℃1min
232℃3-24min*
365℃30min
44℃保持

*注:确切的片段化反应时间需要根据DNA的实际上样量进行优化。下表1中列出10ng、100ng和1000ng上样量DNA片段化所需的时间,用户可以依据此时间进行调整。调整过程中,咱们推荐额外设置一个反应时间延长3min以及一个缩短3min的对照。这样有助于确定切割至所需片段大小时所需要的准确反应时间。关于片段化时长的更多建议,请参考附录II。

表1:片段化时间选择表(32℃)
DNA主峰大小250bp350bp450bp550bp
10ng DNA上样量24min16min14min10min
100ng DNA上样量16min10min8min6min
1000ng DNA上样量14min8min6min4min


2.请按下表配制反应体系,冰上操作,各组分加入后,请轻柔吸打混匀,注意不要涡旋。

??当DNA上样量>10 ng
成分用量
10×FEA Reaction Buffer5 μl
DNA样本X μl
Nuclease-Free ddH2O(35-X) μl
总体积40 μl

??当DNA上样量≤10 ng
成分用量
10×FEA Reaction Buffer5 μl
DNA样本X μl
FEA Enhancer2.5 μl
Nuclease-Free ddH2O(32.5-X) μl
总体积40 μl

??注:对于多个反应,请计算所需试剂的总体系并在此基础上增加体系10%,以避免因溶液转移过程中挂壁损失而造成分装反应数不足的问题。
3.取1个新的200 μl薄壁管置冰上,向管中加入10 μl 5×FEA enzyme Mix,随后将(2)中反应体系转移40 μl至同一薄壁管中,轻柔吸打混匀6-8次。
4.瞬时离心薄壁管,立即置于已预冷至4℃的PCR仪中,并启动反应程序。
5.当反应程序结束后,将薄壁管从PCR仪中取出并置冰上。
6.马上进入接头连接步骤,为保证连接效率,推荐使用Fast Ligation Reagent(WH0201-01/02)。

附录I:DNA样品溶液中二价盐离子以及EDTA的去除
请参照供应商提供的步骤进行纯化。
1.若DNA溶液体积小于50 μl,请用无核酸酶的去离子水补足体积至50 μl。
2.加入90 μl(1.8倍体积)完全涡旋混匀的Agencourt AMPure XP磁珠至DNA溶液中,吸打混匀。若DNA溶液体积大于50 μl,请根据DNA溶液的实际体积,加入1.8倍体积完全涡旋混匀的Agencourt AMPure XP磁珠。
3.室温孵育5 min后,将反应管置于磁力架上2~4 min收集磁珠,小心去除上清液。
4.用200 μl 80%乙醇洗涤磁珠,将反应管置于磁力架上收集磁珠,弃去上清。重复此洗涤步骤一次。
5.将反应管置于磁力架上,打开离心管盖于室温条件下晾置10 min或至磁珠干燥为止。
6.加入45 μl 10mM Tris-HCl(pH8.0)使磁珠完全悬浮后,置磁力架上2 min。待磁珠贴壁后小心转移42.5 μl上清至新的离心管。
7.使用Quibit、Picogreen或其他荧光定量方法测定纯化后的DNA浓度。

附录II:优化片段化处理时间
片段化反应时间需要根据DNA上样量进行优化,参考图1所示曲线选择反应时间。优化过程请使用将实际用于测序的DNA样品,这将有助于在测序时保证片段化过程的可重复性。初次优化时,咱们推荐添加2个额外的反应时间,即依据图中曲线选择反应时间后,在此时间基础上分别延长和缩短3min。若对片段大小有较精确的要求,可在此基础上继续对反应时间进行微调。在实际操作中,若DNA上样量≥10 ng,用户可在片段化步骤完成后即对反应效果进行评价。具体方法为使用1.8倍体积AMPure@XP磁珠对反应产物进行纯化,并将其溶解于10 μl Tris溶液或去离子水。然后使用Bioanalyzer High Sensitivity试剂盒确定片段分布。
对于上样量<10 ng的片段化反应,为了节省反应时间,咱们推荐在每个反应体系中(50 μl)添加2.5 μl的FEA Enhancer。反应时间则推荐使用图1中将10 ng DNA切割至特定片段大小所需时间的一半。例如:若希望DNA片段集中于350 bp,则加入FEA Enhancer后反应10 min左右即可。
不同DNA上样量经片段化后产出片段大小与反应时间对应曲线
图1不同DNA上样量经片段化后产出片段大小与反应时间对应曲线

附录III:1×TE溶液中DNA的片段化/末端修复/A尾添加
当DNA溶解于1×TE溶液中时,请参照以下步骤进行DNA的片段化/末端修复/A尾添加反应。
1.按照下表设置PCR仪反应程序。请确认在反应中开启热盖。如有可能,请将热盖温度设置为70℃。DNA上样量为1-1000ng。
反应步骤反应温度反应时间
14℃1min
232℃5-35min*
365℃30min
44℃保持

*注:反应时间需根据DNA的实际上样量进行优化。若DNA上样量≥10 ng,反应体系中加入2.5 μl FEA Enhancer,推荐使用25 min作为起始反应时间,此时产生的片段主要集中于300-500 bp;若DNA上样量<10 ng,反应体系中加入5 μl FEA Enhancer,则推荐使用15 min作为起始时间,此时片段集中于300 bp。若需要进行调整,则请以3min为单位,在原反应时间基础上进行增减,直至得到所需要的片段大小。

2.为了保证良好的试验效果,请严格按照以下说明进行操作。在一个新的薄壁管中参照下表配制反应体系,此步请于冰上操作,配置好的反应体系经轻柔吸打混匀,注意不要涡旋震荡。

??当DNA上样量≥10ng
成分用量
10×FEA Reaction Buffer5μl
DNA样本X μl
FEA Enhancer2.5μl
Nuclease-Free ddH2O(32.5-X) μl
总体积40μl

??当DNA上样量<10ng
成分用量
10×FEA Reaction Buffer5μl
DNA溶液X μl
FEA Enhancer5μl
Nuclease-Free ddH2O(30-X) μl
总体积40μl

1.取新的PCR薄壁管置冰上,加入10 μl 5×FEA Enzyme Mix。随后将上一步准备好的反应体系转移40 μl至同一薄壁管中。轻柔吸打混匀6-8次。注意操作过程中请保持反应管置于冰上。
2.将薄壁管瞬时离心后,立即转移至已预冷至4℃的PCR仪中,并启动反应程序。
3.当反应程序结束,PCR仪温度降至4℃后,将薄壁管从PCR仪中取出并置冰上。马上进入接头连接步骤,为保证连接效率,推荐使用Fast Ligation Reagent(WH0209-01/02)。
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