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产品目录

一站式DNA非变性PAGE电泳套装图片
产品货号:
BTN100205
中文名称:
一站式DNA非变性PAGE电泳套装
英文名称:
One-Stop DNA Native PAGE Pack
产品规格:
30次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本品就是专门用于非变性PAGE的试剂。非变性PAGE电泳是研究SSCP-PCR(single-strand conformation polymorphism-PCR、单链PCR片段构象多态性)和凝胶滞阻(Gel Shift)的重要研究手段,因为在非变性PAGE中,DNA的迁移率除跟长短相关外,还跟其构象和结合的蛋白质相关。

产品特点:
1.一站式,用户只需要准备水和样品,十分方便。
2. 安全,免去了实验人员接触粉末状的剧毒物品丙烯酰胺。
3. 灵活,高浓度的丙烯酰胺溶液可用于配制各种浓度的PAGE胶,分开提供的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺可用于配制各种交联度的PAGE胶。
4. PAGE电泳后可直接用于银染等后续试验。

产品组成:
成分规格保存
丙烯酰胺60g室温
甲叉双丙烯酰胺2g室温
TEMED1.5ml4℃,避光
过硫酸铵(干粉)1g室温
非变性PAGE上样液,2×1ml4℃
10×TBE(BTN90313)250ml室温
说明书1份


储存条件:常温运输,保存条件见上表,有效期一年。

使用方法:
用于SSCP-PCR分析的非变性PAGE电泳(其他应用请相应修改参数)

一、PAGE浓度的选择:最好使用浓度为5-12%的丙烯酰胺胶,因为SSCP-PCR的扩增长度一般在150-200bp之间,而5%的PAGE的有效分辨范围为80-500bp、8%的PAGE的有效分辨范围为60-400bp、12%的PAGE的有效分辨范围为40-200bp。

二、PAGE交联度的选择:交联度越低,孔径越大,对DNA分子构象的变化越灵敏,SSCP分辨率越高,但过低则胶太软,不好进行电泳后的后续操作,所以一般选择1-2%的交联度(即丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺在49:1到48:2之间)。

三、体积的选择:SSCP-PCR检测需要长约30-40cm的测序胶板,可以结合梳子的厚度,计算胶的体积。
操作:
1. 配制PAGE胶(这是配制100mL胶的用量,配制更大体积的胶则需以此用量为基础按比例增加)
A:新鲜配制10%的APS(过硫酸铵):按每0.1克过硫酸铵干粉加1mL超纯水的比例将水加到装有硫酸铵干粉的1.5mL EP管中,摇晃到粉末全部溶解。配制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周。
B:新鲜配制适当交联度29:1的30%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液(AB溶液,下同):在本产品提供的装有60 g丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入146mL自备的去离子水和全部的甲叉双丙烯酰胺,充分摇晃直到溶解(约需10-20分钟),即得到30%的AB(29:1)溶液。此溶液最好在一个月内用完,必须4℃避光保存。
C:配SSCP PAGE胶:在一个250mL的三角瓶中,先按下表的用量加入去离子水、30% AB溶液溶液和10×TBE缓冲液。丙烯酰胺单体溶液具有神经毒性,一定要戴手套操作。
PAGE胶浓度各成分用量(单位:ml)总体积(ml)
去离子水30%AB溶液10×TBE缓冲液
5%73.416.610.0100
6%70.020.010.0100
7%66.723.310.0100
8%63.326.710.0100
9%60.030.010.0100
10%56.733.310.0100
11%53.336.710.0100
12%50.040.010.0100

注:有大量文献报道PAGE胶中加入5%-10%的甘油能提高某些位点的分辨率。如果选择加入10%的甘油,则减少去离子水的用量10mL,同时加入10mL甘油。
D:摇晃混匀。最好能抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气(氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应),无条件也可以不脱氧。
E:加入500μL 10%APS和100μL TEMED,迅速摇匀后倒胶。
F:在胶的液面距离达到顶部时停止灌胶,插入梳子。
G:室温聚合30-60分钟(低温抑制聚合反应)。
H: 拔出梳子,用1×TEB液冲洗加样孔。
I: 放4℃冰箱预冷30分钟-12小时。为了防止胶收缩,最好顶部加少量1×TBE缓冲液。预冷的胶有利于保持单链DNA的构型。
2. 将预冷的凝胶板固定在电泳装置上,往上槽和下槽中加入足够1×TEB电泳液。
3. 取3-5μl SSCP-PCR样品,加入等体积2×非变性PAGE上样液,85℃处理5分钟后冰浴。用前短暂离心后取2μl上样。
4.连接电源线,打开电源开关。如果PAGE中不含甘油,则使用25W的功率,电泳5-7小时(对3—40cm长的PAGE胶而言)。如果使用含甘油的PAGE,则使用8W的功率,电泳16-18小时。由于温度变化过大会改变DNA构型,所以电泳时最好能保持恒温。对不含甘油的PAGE,最好恒温在4℃、对含甘油的PAGE,最好恒温在25℃。
5. 终止电泳,取出凝胶进行后续的处理(如银染)。

疑难解答:
一、为何SSCP-PCR带型有复合条带?
原因之一:可能是残留的PCR引物跟单链的DNA结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。
原因之二:可能是PCR产物用量过高,彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4-8倍后使用。
二、如何提高电泳分辨率?
可以在配胶时加入甘油(终浓度为5%-10%),因为甘油是弱变性剂,能部分展开DNA折叠结构,增加表面积,增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大,电泳速度变慢,因此只适合室温电泳使用,不要4℃电泳。如果条件允许,最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。
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