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产品目录

miRNA提取试剂盒图片
产品货号:
WE0195
中文名称:
miRNA提取试剂盒
英文名称:
miRNA Purification Kit
产品规格:
50次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
??本试剂盒专用于从各种动物组织、植物组织、细胞、血清、血浆等样本中分离纯化miRNA, 还可以提取siRNA,snRNA等其他小于200nt的小分子RNA,同时也可用于总RNA的提取。本品将酚/胍裂解技术和硅基质膜纯化技术相结合,独特的裂解液在有效抑制RNases的同时,可以通过有机抽提的方法除去细胞或组织样品中的大部分DNA和蛋白。对于一些敏感的下游实验中,如需富集miRNA可适用该试剂盒单独对miRNA进行富集。本品适用样本范围广,制备的RNA纯度高,可直接用于敏感的下游应用,如Northern Blot分析,Real-Time PCR,Microarray Analysis等。

试剂盒组成
组份50次
TRIzon Reagent60ml
Buffer RWT(浓缩液)15ml
Buffer RW2(浓缩液)11ml
RNase-Free Water10ml
吸附柱RM及收集管50套
吸附柱RS及收集管50套
RNase-Free离心管(1.5ml)50个

保存条件:TRIzon Reagent 2~8℃避光保存,其它组分室温(15~30℃)。

自备试剂:氯仿、无水乙醇(新开封或提取RNA专用)。

实验前准备及重要注意事项
1、预防RNase污染,应注意以下几方面:
1)使用无RNase的塑料制品和枪头,避免交叉污染。
2)玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时,塑料器皿可在0.5 M的NaOH中浸泡10分钟,用水彻底冲洗后高压灭菌。
3)配制溶液应使用无RNase的水。
4)操作人员戴一次性口罩和手套,实验过程中要勤换手套。
2、提取的样品避免反复冻融,否则影响miRNA提取的量和质量。
3、第一次使用前应按照试剂瓶标签说明在Buffer RWT和Buffer RW2中加入无水乙醇。
4、所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行,且所有操作步骤动作要迅速。

操作步骤

方法一:miRNA富集(可直接用于敏感的下游实验)
1、样品处理
①组织:将组织在液氮中磨碎。每30-50 mg组织加1ml TRIzon Reagent,震荡混匀。样品体积不超过TRIzon Reagent体积的十分之一。
②单层培养细胞:吸去培养液,加入TRIzon Reagent,每10cm2加入1ml TRIzon Reagent(裂解液用量视培养瓶面积而定)。
③细胞悬液:离心得到细胞沉淀,弃上清。每5×106-1×107细胞加入1ml TRIzon Reagent(细胞不需洗涤)。
④血浆或血清:取200μl血浆或血清样本,加入5倍体积TRIzon Reagent,震荡混匀30秒。
2、样品中加入TRIzon Reagent后反复吹打几次,使其充分裂解。室温放置5分钟,使蛋白核酸复合物完全分离。
3、可选步骤:4℃ 12000rpm(~~13400×g)离心5分钟,取上清,转入一个新的离心管(自备)中(如样品中含较多蛋白、脂肪、多糖等,可选做此步骤)。
4、向上清中加入氯仿,每使用1ml TRIzon Reagent加入200μl氯仿,盖好管盖,剧烈振荡15秒,室温放置5分钟。
5、4℃ 12000rpm离心15分钟,样品分为三层:红色有机相,中间层,无色水相,将上层无色水相移到一个新的离心管(自备)中。
6、向步骤5得到的溶液中加入1/3倍体积的无水乙醇, 混匀,将得到的溶液和沉淀一起转入已装入收集管的吸附柱RM中。若一次不能将全部溶液加入吸附柱,请分多次转入。12000rpm离心30秒,离心后弃掉吸附柱RM,保留流出液。
7、向步骤6得到的溶液中加入2/3倍体积的无水乙醇,混匀。
8、将上步所得溶液和沉淀一起转入已装入收集管的吸附柱RS。若一次不能将全部溶液加入吸附柱,请分多次转入。12000rpm离心30秒,倒掉收集管中废液,将吸附柱RS重新放回收集管中。
9、向吸附柱RS中加入700μl Buffer RWT(使用前检查是否加入无水乙醇),12000rpm离心30秒, 倒掉收集管中的废液,将吸附柱RS重新放回收集管中。
10、向吸附柱RS中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否加入无水乙醇), 12000rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱RS重新放回收集管中。
11、重复步骤10。
12、12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液。将吸附柱RS置于室温数分钟,以彻底晾干。
注意:此步骤的目的是将吸附柱RS中残留的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
13、将吸附柱RS置于一个新的无RNase离心管中,向吸附柱中间部位加入30-50μlRNase-Free Water,室温放置1分钟,12000rpm离心1分钟,收集RNA溶液,得到的RNA溶液保存在-70℃,防止降解。
注意:
1)RNase-Free Water体积不应小于30μl,体积过小影响回收率。
2)如果要提高RNA的产量,可用30-50μl新的RNase-Free Water重复步骤13。
3)如果要提高RNA浓度,可将得到的溶液重新加入到吸附柱RS中,重复步骤13。

方法二:总RNA的提取(提取的总RNA包括miRNA等其他<200 nt的小分子RNA)
1~5步骤同方法一。
6、向步骤5得到的溶液中加入1.25倍体积的无水乙醇,混匀。
7、将上步所得到的溶液和沉淀一起转入已装入收集管的吸附柱中。若一次不能将全部溶液加入吸附柱RM中,请分多次转入。12000rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱RM重新放回收集管中。
8、向吸附柱RM中加入700μl Buffer RWT(使用前检查是否加入无水乙醇), 12000rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱RM重新放回收集管中。
9、向吸附柱RM中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否加入无水乙醇), 12000rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱RM重新放回收集管中。
10、重复步骤9。
11、12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液。将吸附柱RM置于室温数分钟,以彻底晾干。
注意:此步骤的目的是将吸附柱RM中残留的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
12、将吸附柱RM转入新的无RNase离心管中,向吸附柱中间部位加入30-50μl RNase-Free Water,室温放置1分钟,室温 12000rpm离心1分钟,收集RNA溶液,得到的RNA溶液保存在-70℃,防止降解。
注意:
1)RNase-Free Water体积不应小于30μl,体积过小影响回收率。
2)如果要提高RNA的产量,可用30-50μl新的RNase-Free Water重复步骤12。
3)如果要提高RNA浓度,可将得到的溶液重新加入到吸附柱RM中,重复步骤12。

储存条件:室温(15~30℃)。
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