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产品目录

镍-琼脂糖凝胶H.P.图片
产品货号:
QN4070
中文名称:
镍-琼脂糖凝胶H.P.
英文名称:
Ni Sepharose H.P.
产品规格:
25mL
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
Ni-琼脂糖凝胶H.P.是用于纯化6×His标签重组蛋白的一种纯化介质,它是由6%交联的Sepharose耦连了一种四齿螯合剂NTA而得。它可用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的6×His标签重组蛋白。NTA,含有四个螯合区,较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+。6×His可与Ni2+螯合,从而使His标签蛋白结合在Ni-NTA纯化介质上,未结合的蛋白被洗涤下去,结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低pH缓冲液的温和洗脱下来,从而得到高纯度的目的蛋白。该纯化介质与His标签蛋白具有极高的亲和力,可达5~20mg/mL。可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的His标签蛋白。纯化程序简单,所得的蛋白纯度可高达95%。Ni-NTA可再生4~6次,重复使用。本产品悬浮液为20%乙醇,已螯合Ni2+

操作方法:
非变性条件下抽提His标签蛋白:
1.准备细胞,接种,诱导表达。收集细胞,置于-70℃或马上进行步骤2操作。
2.加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作浓度为1mM现用现加。
3.将细胞悬浮起来,加入溶菌酶,混匀,冰上放置30分钟,超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。
4.加入10% Triton X-100,使终浓度为0.05%,充分混匀,冰上放置15分钟。
5.12000rpm/min(20,000×g以上),4℃离心15分钟以上。取上清,置于冰上备用或-20℃保存。
6.将NTA树脂装入合适的层析柱,层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗。
7.将样品加至NTA层析柱中,流速在15mL/h左右,收集穿透部分,用SDS/PAGE分析蛋白的结合情况。
8.层析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗,流速控制在30 mL/h左右。
9.分别用5倍NTA体积的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000 Buffer洗脱,流速控制在15mL/h左右,收集洗脱液,每管收集一个NTA体积。
10.确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS-PAGE分析。也可以用Bradford蛋白质测定试剂盒,快速确定蛋白质的含量,然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。
11.纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。
??NTA-0、20、40、60、80、100、200、1000Buffer分别为浓度20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,添加0、20、40、60、80、100、200、1000mM Imidazole。

变性条件下从包涵体中纯化His标签蛋白:
1.准备细胞,接种,诱导表达。收集细胞,置于-70℃或马上进行步骤2操作。
2.加入1/20细胞生长体积的GuNTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作浓度为1mM现用现加。
3.将细胞悬浮起来,冰上超声破碎细胞,降低粘稠度。
4.室温放置30分钟,间或混匀或用磁力搅拌。
5.12000转/分(20,000×g以上),4℃离心15分钟以上。取上清,置于冰上备用或-20℃保存。
6.将NTA树脂装入合适的层析柱,层析用10倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗。
7.将样品加到NTA层析柱中,流速控制在15mL/h左右,收集穿透部分,用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。
8.层析用5倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗,流速控制在30 mL/h左右。
9.分别用5倍NTA体积GuNTA-20、GuNTA-40,GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500洗脱,流速在15mL/h左右,收集洗脱液,每管收集一个NTA体积。
10.确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford蛋白质测定试剂盒,快速确定蛋白质的含量,然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。
11.目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。12)纯化的目标蛋白质需要复性,复性常用的手段可以参考有关手册确定的原则。
??GuNTA-0、20、40、60、100、500Buffer分别为浓度20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,6M Guanidium HCl添加0、20、40、60、100、500mM Imidazole。

NTA树脂再生:
NTA树脂的再生NTA树脂在使用若干次数(3-5次)后,结合效率有所下降,可以用以下方法再生,提高树脂的使用寿命和蛋白质的结合效率。NTA树脂再生前需要从层析柱下端流干所有溶液,估计出NTA的树脂体积,按下列次序将再生试剂加到层析柱里,在等上一步再生溶液流干后,再加下一步再生溶解。用户需要自行准备25%、50%、75%、100%(v/v)乙醇和去离子水。从层析柱下端流干所有溶液,用2倍NTA树脂体积的Stripping Solution I、2倍体积的去离子水、3倍体积的Stripping Solution II、1倍体积的25%乙醇、1倍体积的50%乙醇、1倍体积的75%乙醇、5倍体积的100%乙醇、1倍体积的75%乙醇、1倍体积的50%乙醇、1倍体积的25%乙醇、1倍体积的去离子水、5倍体积的Stripping Solution III、3倍体积的去离子水分别洗一遍。如果马上使用,用5倍体积的Ni Charging Solution洗,再用10倍体积的平衡溶液(NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer)洗;如果想长期储存,加入1倍体积的20%乙醇,4℃保存,使用前用5倍体积的Ni Charging Solution洗,再用10倍体积的平衡溶液(NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer)洗再生溶液配方:
Stripping Solution I:6M GuHCl,0.2M acetic acid
Stripping Solution II:2% SDS
Stripping Solution III:100mM EDTA(pH8.0),Ni Charging Solution:100mM NiSO4
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